疏水層析替代反相層析在核酸藥物純化工藝中的應用

核酸藥物是繼抗體藥之后備受市場期待的下一代生物藥物。目前全球已有12種核酸藥物獲批上市,預計今后每年將會有3~4種核酸藥物獲批。作為主流核酸藥物的合成寡核苷酸,在經過固相法或液相法的化學合成工藝后,通過反相層析(RPC)或離子交換層析(IEC)等方法進行分離和純化。

但是,普通RPC工藝無法完全去除目標產物中的相關雜質,而且由于大量使用有機溶劑,需要進行廢液處理、配備防爆設備等,會產生對成本控制不利等因素。因此,相關人員正在研究使用可代替RPC的層析工藝——疏水層析



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與RPC相比,疏水層析的優勢?



● 可以去除固相合成時從固相導出的樣品溶液中含有的氫氧化銨等低分子。

● 合成過程中,保護基二甲氧三苯甲基 (DMT) 與目標物質結合的DMT-on目標物,與保護基脫落生成的DMT-off雜質更容易被分離

● 可以分離目標產物的相關雜質,即N-1雜質、N+1雜質、P=0雜質、氰乙基化 (CNEt) 雜質、無堿基雜質等。

● 使用酸性洗脫液,可在柱內完成目標產物的脫三苯甲基化 (DMT基團的脫保護) 。

● 聚合物基質的填料可使用堿性溶液 (pH13以下),還可用NaOH溶液對層析柱進行CIP清洗。

● 由于洗脫液幾乎不使用有機溶劑,所以無需配備防爆設備,還可減少廢液處理的費用


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合成寡核苷酸的純化精制工藝示例





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疏水層析填料分離合成寡核苷酸的實例


以下實例中使用了東曹公司的4種疏水填料對粗純的寡核苷酸進行分離。



從上述各種類型的HIC填料分離粗純的寡核苷酸的結果來看,DMT-off雜質在所有的HIC填料上均無法被吸附,而是直接流穿。另外,從目標產物的洗脫位置、與雜質的分離度 來看,TOYOPEARL Phenyl-650M和Butyl-650M這兩款填料更適用于寡核苷酸的純化


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使用疏水填料分離合成寡核苷酸時,柱內DMT基的脫保護處理


使用TOYOPEARL Phenyl-650M進行分離時,色譜柱進樣、吸附粗純的寡核苷酸 (DMT-on目標物) 樣品后,先通過淋洗去除樣品中DMT-off雜質。然后,在洗脫液中加入50 mmol/L醋酸、1 mol/L硫酸銨溶液在柱內對目標產物進行DMT基的脫保護 (脫三苯甲基反應) 處理,從而獲得脫三苯甲基DMT-off的最終目標產物。

另外,脫保護的DMT基團會吸附在色譜柱上,在CIP階段 (用蒸餾水和30%的異丙醇清洗) 被洗脫去除。經此純化,目標產物的回收率為99%,RPC-HPLC檢測純度達99%以上。由此證明,寡核苷酸可以使用HIC填料進行有效精制。




參考文獻:

1)  Hybridon Inc., Patent WO 96/01268(1996)

2)  K. Ruanjaikaen et al., presentation by BioProcess International West(2017),San Francisco, USA

3)  Biogen MA Inc., Patent WO 2017/218454 A1(2017)


發布時間:2021/3/19
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